RNA de interferência (RNAi): Uma nova estratégia para a proteção de plantas e supressão de resistência
Fonte: RNAi technology in crop protection against arthropod pests, pathogens and nematodes
Moises Zotti, Ericmar Avila dos Santos, Deise Cagliari
Pest Management Science – Novembro 2017
http://dx.doi.org/10.1002/ps.4813
Introdução: Tecnologias para a proteção de cultivos utilizando o mecanismo de RNAi passam por um momento decisivo, com a recente aprovação de produtos comerciais em países da América do Norte. Este fato demonstra o resultado de um esforço continuo e cooperativo de mais de 20 anos, entre a academia e a indústria, que acreditaram na transferência de todo o conhecimento acerca do tema em estratégia de controle, agora disponíveis comercialmente. Desta forma, o momento é oportuno para uma primeira avaliação crítica, delineando direções da aplicação dessa tecnologia na agricultura, para a proteção de plantas e na supressão de resistência.
O mecanismo: A descrição do mecanismo de RNA de interferência (RNAi) foi uma das mais importantes descobertas científicas dos últimos 20 anos. No contexto da proteção de plantas essa tecnologia tem se destacado como uma ferramenta versátil e eficiente com potencial aplicação no manejo fitossanitária das lavouras, e na supressão de genes envolvidos em mecanismos de resistência.
A ocorrência desse mecanismo foi identificada nos mais diversos organismos, como insetos, fungos, nematoides e plantas. O RNAi ocorre naturalmente nesses organismos, funcionando como uma forma de regulação na produção de proteínas, defesa contra vírus invasores, entre outras funções. Esse mecanismo baseia-se no seccionamento do RNA mensageiro (RNAm). O silenciamento gênico ocorre pelo pareamento de uma pequena sequência de RNA ao RNAm e a posterior degradação dessa sequência por enzimas pertencentes a maquinaria de silenciamento gênico. O pareamento desses pequenos RNAs ao RNAm é altamente especifico, uma vez que a degradação não ocorre caso essa condição não seja atendida.
Diante dessa alta especificidade do mecanismo, é possível a utilização da tecnologia para o silenciamento de um ou mais genes de uma determinada espécie, diferentemente dos pesticidas convencionais, os quais na sua grande maioria, não possuem alta especificidade.
Aplicação da tecnologia: Produtos à base de RNAi devem chegar ao mercado de duas formas: plantas geneticamente modificadas ou métodos não-transgênicos (via produtos pulverizáveis, injeção em caule, irrigação, tratamento de sementes ou pó/granulado) tanto para culturas anuais quanto perenes (para mais detalhes: https://doi.org/10.3389/fphys.2016.00553). A utilização de métodos não transgênicos baseia-se principalmente na utilização de formulações contento dupla fita de RNA (dsRNA), molécula precursora dos pequenos RNAs (siRNAs), responsáveis pelo silenciamento, os próprios siRNAs, ou uma mistura de ambos.
A utilização de plantas de milho geneticamente modificadas contendo a tecnologia de RNAi para o controle de Diabrotica virgifera foi liberado no Canadá em 2016 e em junho de 2017 foi liberada nos Estados Unidos da América (EUA). Esses eventos de liberação foram um marco na utilização da tecnologia RNAi na agricultura, uma vez que essa tecnologia antes tão distante da utilização no campo agora está disponível para os produtores nesses locais como ferramenta de manejo no controle de pragas.
Contudo, o desenvolvimento de plantas transgênicas exige muitos anos de pesquisa além de um alto investimento. Nesse sentido, a aplicação de RNAi via métodos não transgênicos tem recebido a atenção de pesquisadores e indústria. Aplicações via foliar tem mostrado respostas promissoras, com alta mortalidade de coleopteros quando expostos a plantas tratadas com dsRNA. Outra característica importante da aplicação de dsRNA via foliar é a sua ação sistêmica, verificando-se a presença de dsRNA em regiões não tratadas da planta uma hora após a aplicação, mostrando que a dsRNA pode ser translocada na planta.
Produtos baseados em RNAi têm potencial para fornecer uma solução nova e complementar o manejo dos problemas fitossanitários nas lavouras, com potência e seletividade muito além do que é documentado utilizando métodos convencionais de controle, como pesticidas químicos.
Possíveis alvos da tecnologia: RNAi pode controlar a expressão de genes em qualquer organismo, desde que esteja presente e funcional. Pela sua alta versatilidade pode ser considerado como uma caixa de ferramentas, como diversos alvos em potencial incluindo insetos, ácaros, patógenos, nematoides além da supressão da resistência metabólica em plantas daninhas e insetos.
Na classe dos insetos, a eficiência da tecnologia varia grandemente entre as diferentes ordens, sendo Coleoptera a que apresenta o maior número de casos de sucesso. Ainda, é importante ressaltar que mesmo dentro da mesma ordem há uma variação na eficiência do silenciamento, devido a características particulares de cada espécie.
No que diz respeito ao manejo da resistência, a tecnologia de marca “BioDirectTM” utiliza o mecanismo de RNAi para silenciar o gene responsável pela produção da proteína enol-piruvil shiquimato fosfato sintase (EPSPS) em plantas daninhas resistentes. Essas plantas possuem um maior número de cópias do gene responsável pela produção da proteína EPSPS. A empresa responsável pela tecnologia relata que a pulverização da dsRNA sobre plantas resistentes pode restaurar significativamente a atividade do glifosato, mas ainda carece de dados conclusivos.
A utilização de RNAi no manejo fitossanitário tem mostrado resultados de sucesso em diversos organismos. Porém, é importante lembrar que chave para o sucesso dessa tecnologia não está apenas na escolha do gene alvo para o silenciamento, mas também no fornecimento de quantidades suficientes de dsRNA intacta. Para a utilização do RNAi devem ser realizados estudos dos genes silenciados no organismo alvo, assim como a dose de dsRNA necessária para a obtenção de uma resposta de silenciamento adequada e formas de aplicação da tecnologia.
Custos da tecnologia e métodos de produção: Estima-se que seja necessário a utilização de 2 a 10 gramas de dsRNA por hectare, variando em função das características da espécie alvo. Os custos para produção de dsRNA vem caindo significativamente ao longo dos anos, passando de U$ 12.500 dólares por grama em 2008, para cerca de U$ 2 dólares em 2017. Dentre os métodos de produção destaca-se aquele através de uma cepa específica da bactéria Escherichia coli [HT115(DE3)]. Esta bactéria contendo uma dsRNA específica pode ser pulverizada diretamente e em grandes áreas devido a possibilidade de produção em grandes quantidades. Outro método de produção de dsRNA em larga escala e a baixo custo chamado “Apse RNA Containers” (ARCs) permite a produção de dsRNA encapsulada com proteínas de capsídeos. Neste sistema a dsRNA é planejada adicionando-se uma sequencia que será auto-acoplada a estes capsídeos, sendo no final do processo a dsRNA estará pronta e formulada para aplicação.
Com o avanço das pesquisas nessa área a expectativa é que os custos para a produção de dsRNA sejam ainda mais barateados, deixando essa tecnologia mais acessível.
Avaliação de risco e resistência: RNAi é uma tecnologia emergente que abre novos horizontes de oportunidades para estratégias inovadoras no controle de pragas. Apesar da alta especificidade do mecanismo de RNAi, a ocorrência de silenciamento de genes não alvo em organismos não alvo é uma possibilidade que deve ser considerada. A investigação desses efeitos em espécies não alvo pode ser iniciado com a utilização de ferramentas de bioinformática na predição da possibilidade da ocorrência de silenciamento em espécies não-alvo. O silenciamento de genes não alvo, na espécie alvo não é uma preocupação para avaliação do risco desta tecnologia, por outro lado, o silenciamento de genes não alvo em organismos não alvo representa a grande ameaça que deve ser analisada com cautela.
A resistência de insetos a novas tecnologias sempre será uma preocupação devido a grande plasticidade fenotípica e genotípica do grupo. Entretanto mecanismos clássicos de resistência como mutações em sítio alvo são improváveis de ocorrência considerando longos fragmentos (300-600 pb). Longos fragmentos de dsRNA > 200 nucleotídeos resulta em um grande número de diferentes siRNAs correspondentes ao mRNA, e desta forma aumenta a resposta do mecanismo prevenindo a seleção de organismos. Entretanto, outros mecanismos como mudança na cinética da dsRNA por barreiras na absorção e transporte; ainda mudanças nos componentes da maquinaria de RNAi, com as enzimas, falta de reconhecimento da dsRNA pelas ribonucleases (ex. Dicer), boqueio do mecanismo sistêmico, ou ainda aumento da taxa de transcrição de genes com a mesma ou similar função do gene silenciado, são alguns dos possíveis mecanismos de resistência que poderão ocorrer se a tecnologia não for usada seguindo as premissas do MIP.
